Eine Terpencyclase aus Streptomyces pristinaespiralis wurde als (+)-(2S,3S,9R)-Pristinol-Synthase charakterisiert. Die Struktur dieses Sesquiterpenalkohols mit einem neuen Gerüst wurde durch NMR-Spektroskopie und monochromatische anomale Röntgendispersion aufgeklärt. Isotopenmarkierungsexperimente ermöglichten es, zwischen verschiedenen Cyclisierungsmechanismen der Terpencyclase zu unterscheiden und den EI-MS-Fragmentierungsmechanismus des Pristinols zu studieren.

Zwei Sesquiterpencyclasen aus Fusarium fujikuroi wurden in Escherichia coli exprimiert und gereinigt. Das erste Enzym war wegen einer kritischen Mutation inaktiv, die Aktivität konnte aber durch Sequenzkorrektur per ortsgerichteter Mutagenese wiederhergestellt werden. Das mutierte Enzym und zwei natürlicherweise funktionale Homologe aus anderen Fusarien konvertierten Farnesyldiphosphat zu Guaia-6,10(14)-dien. Das zweite Enzym produzierte Eremophilen. Die absolute Konfiguration von Guaia-6,10(14)-dien wurde durch enantioselektive Synthese aufgeklärt, während die des Eremophilens aus dem Vorzeichen der optischen Drehung ableitbar war und derjenigen aus Pflanzen entgegengesetzt ist, aber mit der aus Sorangium cellulosum übereinstimmt. Die Mechanismen beider Terpencyclasen wurden mithilfe diverser ¹³C- und ²H-markierter FPP-Isotopomere studiert.

A terpene cyclase from Streptomyces pristinaespiralis was characterized as the synthase for (+)-(2S,3S,9R)-pristinol. The structure of this sesquiterpene alcohol, which has a new carbon skeleton, was established by NMR spectroscopy and single-wavelength anomalous-dispersion X-ray crystallography. Extensive isotopic labelling experiments were performed to distinguish between various possible cyclization mechanisms of the terpene cyclase and to decipher the EI-MS fragmentation mechanism for pristinol.

Two sesquiterpene cyclases from Fusarium fujikuroi were expressed in Escherichia coli and purified. The first enzyme was inactive because of a critical mutation, but activity was restored by sequence correction through site-directed mutagenesis. The mutated enzyme and two naturally functional homologues from other fusaria converted farnesyl diphosphate into guaia-6,10(14)-diene. The second enzyme produced eremophilene. The absolute configuration of guaia-6,10(14)-diene was elucidated by enantioselective synthesis, while that of eremophilene was evident from the sign of its optical rotation and is opposite to that in plants but the same as in Sorangium cellulosum. The mechanisms of both terpene cyclases were studied with various ¹³C- and ²H-labelled FPP isotopomers.

The EI-MS fragmentation mechanism of the bacterial sesquiterpene epi-isozizaene was investigated through enzymatic conversion of all 15 synthetic (¹³C₁)FPP isotopomers with the epi-isozizaene synthase from Streptomyces albus and GC-MS and GC-QTOF analysis including MS-MS. A systematic method, which we wish to call position-specific mass shift analysis, for the identification of the full set of fragmentation reactions was developed.

The biosynthesis of corvol ethers A and B, two sesquiterpenes from Kitasatospora setae, proceeds with involvement of either one 1,3- or two sequential 1,2-hydride shifts. Quantum chemical calculations revealed that the sequence of two 1,2-hydride shifts is energetically favoured. Labelling experiments were in agreement with this finding. In addition, the stereochemical course of a reprotonation step was investigated by incubation of ¹³C-labelled isotopomers of farnesyl diphosphate in water and in deuterium oxide.

Das Sesquiterpenoid 7-epi-Neopetason wurde über das Wieland-Miescher-Keton synthetisiert. Die Verbindung war identisch zu einem zuvor vorläufig identifizierten Bestandteil des Bouquets von Penicillium roqueforti. Fütterungsexperimente mit ¹³C-markierten Isotopomeren von Mevalonolacton zeigten, dass die Oxidation an C12 und die Isomerisierung der C11-C12- zur C7-C11-Doppelbindung unabhängig voneinander und nicht über ein C7-C11-C12-Allylradikal in einem Schritt ablaufen. Fütterung von (11,12,13-¹³C₃)-7-epi-Neopetason resultierte im Einbau der Isotopenmarkierung in PR-Toxin, wodurch die Verbindung als biosynthetisches Intermediat etabliert wurde.

The sesquiterpenoid 7-epi-neopetasone was synthesized via the Wieland–Miescher ketone. The compound was identical to a previously tentatively identified headspace constituent of Penicillium roqueforti. Feeding experiments with ¹³C-labeled mevalonolactone isotopomers demonstrated that oxidation at C12 and an isomerization of the C11C12 to a C7C11 double bond must occur independently and not via a C7-C11-C12 allyl radical in one step. Feeding with (11,12,13-¹³C₃)-7-epi-neopetasone resulted in labelling of the PR toxin, thus establishing this compound as a newly identified pathway intermediate.

Eine uncharakterisierte Terpenzyklase aus Streptomyces pratensis wurde als (+)-(1(10)E,4E,6S,7R)-Germacradien-6-ol-Synthase identifiziert, deren Produkt als zwei ineinander konvertierbare Konformere existiert, wodurch komplexe NMR-Spektren resultieren. Für eine komplette Zuordnung der NMR-Daten wurden alle fünfzehn Isotopomere des (¹³C₁)FPP sowie (¹³C₁₅)FPP synthetisiert und enzymatisch umgesetzt und die Produkte durch diverse NMR-Methoden einschließlich ¹³C,¹³C-COSY analysiert. Die (¹³C)FPP-Isotopomere wurden weiterhin für die Untersuchung der thermischen Umlagerung und des EI-Fragmentierungsmechanismus des Enzymprodukts verwendet.

Die Fütterung von (2,3,4,5,6-¹³C₅)Mevalonolacton an den Pilz Hypomyces odoratus lieferte einen komplett markierten Sesquiterpenether. Die Konnektivität der Kohlenstoffatome wurde aus einem ¹³C,¹³C-COSY-Spektrum erschlossen und ergab eine Struktur, die sich von der für Hypodoratoxid zuvor berichteten unterschied, obwohl die ¹³C-NMR-spektroskopischen Daten übereinstimmten. Die Strukturrevision für Hypodoratoxid wird präsentiert. Dessen absolute Konfiguration wurde vorläufig aus derjenigen des Cometaboliten cis-Dihydroagarofuran abgeleitet. Die Biosynthese wurde durch Fütterung von (3-¹³C)- und (4,6-¹³C₂)Mevalonolacton untersucht, die Einblicke in komplexe Gerüstumlagerungen während der Terpencyclisierung durch ¹³C,¹³C-Kopplungen gaben.

Wir berichten über die funktionale Charakterisierung einer Sesquiterpencyclase aus Kitasatospora setae. Das Enzym konvertiert den Sesquiterpen-Vorläufer Farnesyldiphosphat (FPP) in zwei zuvor unbekannte und instabile Sesquiterpenether, für die wir die Trivialnamen Corvolether A und B vorschlagen. Beide Verbindungen wurden gereinigt und ihre Strukturen durch ein- und zweidimensionale NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Ein Biosynthesemechanismus für die FPP-Cyclisierung durch die Corvolether-Synthase wurde vorgeschlagen. Die Ergebnisse aus Inkubationsexperimenten der Corvolether-Synthase mit isotopenmarkierten Vorläufern waren in Übereinstimmung mit diesem Mechanismus, wohingegen alternative Mechanismen ausgeschlossen werden konnten.

An uncharacterized terpene cyclase from Streptomyces pratensis was identified as (+)-(1(10)E,4E,6S,7R)-germacradien-6-ol synthase. The enzyme product exists as two interconvertible conformers, resulting in complex NMR spectra. For the complete assignment of NMR data, all fifteen (¹³C₁)FPP isotopomers (FPP=farnesyl diphosphate) and (¹³C₁₅)FPP were synthesized and enzymatically converted. The products were analyzed using various NMR techniques, including ¹³C, ¹³C COSY experiments. The (¹³C)FPP isotopomers were also used to investigate the thermal rearrangement and EI fragmentation of the enzyme product.

Feeding of (2,3,4,5,6-¹³C₅)mevalonolactone to the fungus Hypomyces odoratus resulted in a completely labeled sesquiterpene ether. The connectivity of the carbon atoms was easily deduced from a ¹³C,¹³C COSY spectrum, revealing a structure that was different from the previously reported structure of hypodoratoxide, even though the reported ¹³C NMR data matched. A structural revision of hypodoratoxide is thus presented. Its absolute configuration was tentatively assigned from its co-metabolite cis-dihydroagarofuran. Its biosynthesis was investigated by feeding of (3-¹³C)- and (4,6-¹³C₂)mevalonolactone, which gave insights into the complex rearrangement of the carbon skeleton during terpene cyclization by analysis of the ¹³C,¹³C couplings.

Here we present the functional characterization of a sesquiterpene cyclase from Kitasatospora setae. The enzyme converts the sesquiterpene precursor farnesyl diphosphate (FPP) into two previously unknown and unstable sesquiterpene ethers for which we propose the trivial names corvol ethers A and B. Both compounds were purified and their structures were determined by one- and two-dimensional NMR spectroscopy. A biosynthetic mechanism for the FPP cyclization by the corvol ether synthase was proposed. The results from the incubation experiments of the corvol ether synthase with isotopically labeled precursors were in line with this mechanism, while alternative mechanisms could clearly be ruled out.

A flexible, efficient and robust method for the synthesis of isotopically labelled oligoprenyl diphosphates was developed. The method makes use of just a few building blocks (acetone, triethyl phosphonoacetate, and ethyl acetoacetate) from which several isotopomers with deuterium or ¹³C-labelling are commercially available or can be easily obtained by synthesis. Besides these building blocks, a few deuterated reagents were used for the introduction of deuterium labelling. Furthermore, the synthesis of [14-²H]geranylgeranyl diphosphate is reported. The material was used for a stereochemical analysis of the cyclisation reaction catalysed by tuberculosinyl diphosphate synthase from Mycobacterium tuberculosis.

Six ¹³C-labelled isotopomers of mevalonolactone were synthesised and used in feeding experiments with the endophytic fungus Geniculosporium. The high incorporation rates of ¹³C-label into a sesquiterpene that was found in headspace extracts of the fungus enabled unambiguous identification of this volatile as pogostol without the need for compound purification, simply by collecting the volatile fraction with a closed-loop stripping apparatus followed by direct ¹³C NMR analysis (CLSA-NMR). The feeding experiments also gave insights into the biosynthesis of pogostol, including stereochemical aspects of the terpene cyclisation reaction. The possible biological function of pogostol is discussed.