We here report the construction of an E. coli expression system able to manufacture an unnatural amino acid by artificial biosynthesis. This can be orchestrated with incorporation into protein by amber stop codon suppression inside a living cell. In our case an alkyne-bearing pyrrolysine amino acid was biosynthesized and incorporated site-specifically allowing orthogonal double protein labeling.

We report the development of dendritic siRNA nanostructures that are able to penetrate even difficult to transfect cells such as neurons with the help of a special receptor ligand. The nanoparticles elicit strong siRNA responses, despite the dendritic structure. An siRNA dendrimer directed against the crucial rabies virus (RABV) nucleoprotein (N protein) and phosphoprotein (P protein) allowed the suppression of the virus titer in neurons below the detection limit. The cell-penetrating siRNA dendrimers, which were assembled using click chemistry, open up new avenues toward finding novel molecules able to cure this deadly disease.

Wir berichten von der Entwicklung eines “Heterobasenpaars”, das durch Bildung einer Schiff'schen Base kovalent verknüpft wird. Diese Vernetzung erzeugt eine hohe Stabilisierung von DNA-Doppelsträngen, aber kann aufgrund reversibler Iminchemie geöffnet werden. Darüber hinaus ist sogar der enzymatische Einbau der Vernetzung möglich. Unser Heterobasenpaar eröffnet neue Möglichkeiten zur Stabilisierung von DNA-Doppelsträngen und -Nanostrukturen unter Bedingungen, die kompatibel mit biologischen Sytemen sind.

Wir berichten über die Entwicklung von dendritischen siRNA-Nanostrukturen, die das Einbringen von siRNA in schwierig zu transfizierende Zellen wie Neuronen mithilfe eines speziellen Rezeptorliganden ermöglichen. Die Nanopartikel rufen trotz ihrer dendritischen Struktur eine starke siRNA-Antwort hervor. Durch siRNA-Dendrimere gegen das Nukleoprotein (N-Protein) und das Phosphoprotein (P-Protein), zwei Schlüsselproteine des Tollwutvirus (RABV), konnte der Virustiter in Neuronen unter die Nachweisgrenze gesenkt werden. Die mithilfe von Klick-Chemie aufgebauten siRNA-Dendrimere weisen den Weg für eine neuartige Heilungsmöglichkeit dieser tödlichen Krankheit.

Die absoluten Level von 5-Hydroxymethyl- (hmC) und 5-Methylcytosin (mC) in humanen Hirngeweben wurden in Abhängigkeit vom Lebensalter bestimmt. Zusätzlich wurden die absoluten 5-Formylcytosin-Level (fC) in adulten Individuen und die Level dieser modifizierten Cytosinbasen in menschlichen Neuronen quantifiziert. Wir vergleichen diese Daten mit den altersabhängigen Mengen von fC, hmC und mC in Hirngeweben der Maus. Bei hmC wird mit zunehmendem Alter zunächst ein Anstieg der Modifikationsdichte beobachtet. Im voll entwickelten Gehirn steigt das hmC-Level nicht weiter an, sondern bleibt auf einem konstant hohen Niveau von ca. 1.2 % beim Menschen. Dieser Wert ist etwa doppelt so hoch wie das hmC-Level im zerebralen Cortex der adulten Maus. Im Unterschied dazu sinkt das fC-Level in den frühen Entwicklungsstadien mit zunehmendem Alter stark ab. Bei hmC könnte es sich dementsprechend um eine stabile epigenetische Modifikation handeln, während fC in den frühen Gehirnentwicklungsphasen vermutlich eher als Intermediat der aktiven DNA-Demethylierung auftritt.

We report the development of a new heterobase that is held together through reversible bonding. The so-formed cross-link adds strong stabilization to the DNA duplex. Despite this, the cross-link opens and closes through reversible imine bonding. Moreover, even enzymatic incorporation of the cross-link is possible. The new principle can be used to stabilize DNA duplexes and nanostructures that otherwise require high salt concentrations, which may hinder biological applications.

The absolute levels of 5-hydroxymethylcytosine (hmC) and 5-methylcytosine (mC) in human brain tissues at various ages were determined. Additionally, absolute levels of 5-formylcytosine (fC) in adult individuals and cytosine modification levels in sorted neurons were quantified. These data were compared with age-related fC, hmC, and mC levels in mouse brain samples. For hmC, an initial steady increase is observed, which levels off with age to a final steady-state value of 1.2 % in human brain tissue. This level is nearly twice as high as in mouse cerebral cortex. In contrast, fC declines rapidly with age during early developmental stages, thus suggesting that while hmC is a stable epigenetic mark, fC is more likely an intermediate of active DNA demethylation during early brain development. The trends in global cytosine modification dynamics during the lifespan of an organism are conserved between humans and mice and show similar patterns in different organs.

A 5-formyl-2′-deoxycytidine (fdC) phosphoramidite building block that enables the synthesis of fdC-containing DNA with excellent purity and yield has been developed. In combination with phosphoramidites for 5-methyl-dC, 5-hydroxymethyl-dC, and carboxy-dC, it was possible to prepare a segment of the OCT-4 promoter that contains all four epigenetic bases. Because of the enormous interest in these new epigenetic bases, the ability to insert all four of them into DNA should be of great value for the scientific community.

Ein 5-Formyl-2′-desoxycytidin(fdC)-Phosphoramidit-Baustein wurde entwickelt, der die Synthese fdC-haltiger DNA in ausgezeichneter Reinheit und Ausbeute ermöglicht. In Kombination mit Phosphoramiditen für 5-Methyl-dC, 5-Hydroxymethyl-dC und 5-Carboxy-dC gelang die Herstellung eines Segments des OCT4-Promotors, das alle vier epigenetischen Basen enthält. Aufgrund des großen Interesses an diesen neuen epigenetischen Basen sollte die Fähigkeit, alle vier von ihnen in DNA einzubringen, von besonderer Bedeutung sein.

DNA und RNA enthalten neben den vier kanonischen Nukleobasen eine Vielzahl modifizierter Nukleoside, die ihren chemischen Informationsgehalt vergrößern. RNA ist dabei besonders reich an Modifikationen, was offensichtlich das Resultat der Anpassung an ihre komplexen und vielfältigen Aufgaben ist. Die modifizierten Nukleoside und deren chemische Struktur etablieren hierbei eine zweite Informationsebene, welche für die Funktion der RNA-Verbindungen von zentraler Bedeutung ist. Auch die chemische Diversität der DNA ist größer als zunächst erwartet. Neben den vier kanonischen Basen enthält die DNA höherer Organismen insgesamt vier epigenetische Basen: m⁵dC, hm⁵dC, f⁵dC und ca⁵dC. Alle Zellen eines Organismus enthalten das gleiche genetische Material. Daher erfordert die Erfüllung der zahlreichen unterschiedlichen Aufgaben und Funktionen innerhalb dieses Organismus die kontrollierte Aktivierung und Inaktivierung Zelltyp-spezifischer Gene. Die Regulation der zugrundeliegenden Unterdrückungs- und Aktivierungsprozesse erfordert eine zweite, epigenetische Informationsebene, die augenscheinlich direkt mit erhöhter chemischer Diversität verbunden ist. Diese Diversität wird von den modifizierten, nicht-kanonischen Nukleosiden sowohl in DNA als auch in RNA bereitgestellt.

DNA and RNA contain, next to the four canonical nucleobases, a number of modified nucleosides that extend their chemical information content. RNA is particularly rich in modifications, which is obviously an adaptation to their highly complex and variable functions. In fact, the modified nucleosides and their chemical structures establish a second layer of information which is of central importance to the function of the RNA molecules. Also the chemical diversity of DNA is greater than originally thought. Next to the four canonical bases, the DNA of higher organisms contains a total of four epigenetic bases: m⁵dC, hm⁵dC, f⁵dC und ca⁵dC. While all cells of an organism contain the same genetic material, their vastly different function and properties inside complex higher organisms require the controlled silencing and activation of cell-type specific genes. The regulation of the underlying silencing and activation process requires an additional layer of epigenetic information, which is clearly linked to increased chemical diversity. This diversity is provided by the modified non-canonical nucleosides in both DNA and RNA.